近日，我校食品與生物工程學院發酵調味品科學與工程課題組在食品領域國際Top期刊Food Chemistry發表題為“Identifying and molecular mechanisms of novel antioxidant peptides from fermented broad bean paste: A combined insilico and invitro study”的研究論文。食品與生物工程學院林洪斌副教授為第一作者。

文章簡介：

本研究旨在研究發酵蠶豆瓣中抗氧化肽（FBBP）的抗氧化和細胞保護活性，并探討其潛在的分子機制。通過肽組學和計算機生物信息學分析合成了7個新的抗氧化肽（VSRRFIYYL、SPAIPLP、PVPPPGG、KKDGYWWAKFK、LAWY、LGFMQF和LPGCP）。分子對接結果表明，這些肽與Keap1的關鍵氨基酸殘基形成穩定的氫鍵和溶劑可及表面積，從而可能通過占據Keap1上的Nrf2結合位點來調控Keap1-Nrf2通路。這些肽同時具有較強的細胞抗氧化活性，可通過減少ROS和MDA的積累來保護HepG2細胞免受氧化損傷。本研究首次揭示了FBBP中抗氧化肽的分子機制，為FBBP的高值化利用提供了新的理論依據。

文章內容：

蠶豆是一種富含蛋白質的作物，在發酵過程中，大量微生物的劇烈代謝活動將食品基質中的蛋白質轉化為生物活性肽，包括抗氧化肽。在本研究中，最初使用超濾分離將WSP分成三個肽級分，測量每種組分的抗氧化性能。如圖1a-c所示，WSP的結果在0.1至1.0 mg/mL濃度范圍內呈劑量依賴性趨勢，并隨濃度增加而增加。在1.0mg/mL濃度下，DPPH、ABTS和OH-自由基的清除率分別為46.33±2.10%、44.22±0.96%和33.40±0.78%。經超濾分離后的U3自由基清除能力最強，表明隨著分子量的降低，其抗氧化活性逐漸增強。一般而言，分子量越小的肽表現出越強的抗氧化活性。此外，大多數抗氧化肽在其N-末端（即V、L）含有疏水氨基酸，而Pro、His、Tyr、Trp、Cys在序列中。疏水性氨基酸的脂肪族側鏈能夠促進抗氧化肽與多不飽和脂肪酸之間的相互作用，以及與自由基的結合。此外，這些疏水性氨基酸可能更容易暴露在低分子量肽中，有助于肽-脂質相互作用，從而增強自由基的穩定性。

通過RP-HPLC將其分離為四個組分，各峰的抗氧化活性如圖1d-f所示。U3-2對DPPH、ABTS和OH-自由基的清除能力顯著高于其他3個組分（p < 0.05），在1.0mg/mL時，其清除率分別為67.03±0.27%、92.59±0.68%和69.25±2.76%。多肽的抗氧化能力還與芳香族氨基酸和含硫氨基酸的數量和位置有關，故收集了U3-2并用于隨后的肽序列分析。計算機模擬方法已廣泛應用于從食物衍生的蛋白質中發現新的生物活性肽，本研究采用UPLC-ESI-QTOF-MS/MS結合計算機模擬方法（包括Peptide Ranker、Toxin Pred、Pepdraw、Expasy compute pI/Mw分析和構效關系分析）對抗氧化活性最高的組分U3-2進行了鑒定。然而，目前關于抗氧化肽構效關系的研究還缺乏有效的信息。已報道含有芳香族或疏水性氨基酸的肽（Ile, Ala, Val, Phe, Asp, Tyr, Pro, Trp, Gly, Met and Leu）通過增強它們與脂質的相互作用或充當質子或氫供體來促進自由基清除活性。

肽的物理化學性質和生物活性的計算機預測：使用計算機模擬工具對這些肽的5個指標進行了預測（表1）。根據肽的氨基酸序列，使用Peptide Ranker來預測潛在的生物活性，評分范圍為0-1，評分越高意味著生物活性越強，該程序已廣泛用于生物活性肽的預篩選。7種肽均表現出潛在的生物活性，肽排名得分＞0.4。其中，KK-11的得分最高，這可能是由于該序列中重復氨基酸比例高和存在疏水性氨基酸所致。根據Pepdraw結果：KK-11的疏水性最高，為17.79kcal/mol，其次是PG-7（10.30kcal/mol）、LP-5（8.06kcal/mol），LY-4（4.35kcal/mol）的疏水性最低。這些結果與Peptide Ranker程序的預測一致。此外，這些肽的等電點（pI）在5.52和9.99之間，在pH 7時的凈電荷為0、+2或+3。基于Toxin Pred預測得所有肽均無毒性，BIOPEP-UWM對這些多肽的氨基酸序列進行了檢索，結果表明這些多肽均為首次發現。

如圖1g-i所示為七種合成肽的體外抗氧化能力測定：均表現出較強的抗氧化效果，在0.1-1.0 mg/mL的濃度下顯示出劑量依賴性增加趨勢，表明計算機模擬方法可以有效地篩選生物活性肽。DPPH自由基清除活性已被用于評價天然提取物的抗氧化能力，由圖1g可見，LP-5對DPPH自由基的清除率最高（86.40 ± 0.49%，1.0 mg/mL），但低于GSH，其次是LY-4（60.62±1.14%，1.0 mg/mL），而VL-9和KK-11在1.0 mg/mL時無顯著差異（p > 0.05）。已有研究發現抗氧化肽WSAP與DPPH自由基之間存在氫鍵和疏水作用，其氨基酸殘基能有效地與DPPH自由基分子相互作用，從而產生較強的DPPH自由基清除活性。

ABTS適合于測量蛋白質水解產物和肽的自由基清除活性，結果如圖1h所示，LP-5在1.0 mg/mL時表現出最強的ABTS自由基清除能力，清除率為95.20±0.23%，當濃度超過0.8 mg/mL時與GSH無顯著差異（p > 0.05）。LY-4、VL-9和KK-11（1.0mg/mL）對ABTS自由基的清除率分別為88.14±0.72%、90.09±1.14%和78.88±0.62%,抗氧化肽中的氨基酸殘基可以清除與ABTS氫鍵和疏水相互作用的自由基，從而防止體內的氧化損傷。同樣，TSSSLNMAVRGGLTR和STTVGLGISMRSASVR的潛在抗氧化活性是由S和T殘基與自由基的相互作用引起的。LP-5序列中N端L以及Cys和Pro殘基的存在顯著增強了抗氧化能力，這主要歸因于疏水氨基酸和芳香氨基酸的協同作用。另外，Tyr的酚羥基和Trp的吲哚基直接作為氫供體捕獲自由基，從而清除自由基，這也解釋了為什么LY-4具有較強的ABTS自由基清除能力。

LP-5在1.0mg/mL時表現出最強的清除OH-自由基的能力，清除率為80.34±0.66%（圖1i），其次是LY-4（70.41±0.65%）和VL-9（67.06±1.26%）。根據這些合成肽的構效關系（圖2）和體外抗氧化能力（圖1g-i），所有合成肽都具有理想的抗氧化能力。這些肽段可能是促進FBBP高抗氧化活性的活性因子之一，但其抗氧化機制和細胞保護活性尚需進一步研究證實。根據抗氧化能力測定的結果，選擇LY-4、LP-5和VL-9作為代表性多肽，通過分子對接研究其抗氧化損傷的保護機制，同時進行細胞實驗以評價其細胞保護作用。

在分子對接過程中，LY-4、LP-5和VL-9的對接能分別為-80.4859、-52.0058和-112.787kcal/mol。據報道，TX6（PubChem CID：121488089）具有與Keap1結合并激活Keap1-Nrf2途徑的能力,是一種效果較好的抗氧化劑，與Keap 1之間的對接能為?25.45 kcal/mol。這些結果表明，三種抗氧化肽（LY-4、LP-5和VL-9）都能與Keap 1結合，且它們的結合復合物比TX6更穩定。其中，LP-5的自由基清除能力最強，這可能與該序列中Cys的存在有關。已經證實：含硫氨基酸Cys中的巰基易于被自由基氧化，從而保護細胞免受損傷。

抗氧化肽和Keap 1之間具有最低的對接能，其3D結構圖及相應的結合模式如圖3所示，3種抗氧化肽均能很好地嵌入Keap 1的活性空腔中，形成穩定的構象。抗氧化劑與活性殘基之間的結合力主要為碳氫、常規氫和靜電吸引力，其次為鹽橋、π-烷基、π-給體氫、π-陽離子和π-陰離子。此外，π-π T形和π-π堆疊參與結合。如圖3（a）所示，Keap 1和LY-4中的Arg 483和Arg 415之間形成兩個氫鍵，間距分別為2.22和2.23 nm，而殘基Tyr 334和Arg 415形成π-供體氫和碳氫，Keap 1的Arg 483和Arg 415與LY-4形成兩個吸引電荷相互作用。此外，兩個π-陽離子和三個疏水相互作用（Tyr 572（π-π堆積），Tyr 525和Tyr 334（π-π T形）參與結合。由圖3（B）可知，LP-5與Keap 1的Arg 415、Asn 414、Arg 483形成3個氫鍵， LP-5還與Keap 1的Arg 415、Phe 478和Arg 483殘基形成四種電荷相互作用，與Phe 478、His 436和Tyr 525殘基形成三種疏水相互作用（π-烷基）。VL-9可與Ile 416、Ser 431、Arg 483、Gly 433、Gly 364和Gly 603形成8個氫鍵，與Arg 415形成1個π-陽離子相互作用，距離為4.72 nm，與殘基Phe 478形成1個疏水相互作用，其鍵距為4.87 nm（圖3c）。

這些結果表明，氫鍵是這些力之間相互作用最重要且最強的因素，此外，殘基Arg 415和Arg 483在抗氧化肽與Keap 1的結合中起著關鍵作用。

進一步分析了LY-4、VL-9和LP-5與Keap 1對接過程中存在的相互作用表面力。結果表明，表面力主要有六種，包括芳香相互作用、氫鍵作用、疏水性和溶劑可及表面、內插原子電荷和電離性，其中氫鍵作用和SAS是最強的表面力，因此，對這兩種表面力進行了進一步的研究，詳細情況如圖3（d）所示。3種抗氧化肽與Keap 1蛋白活性結構域中的Arg、Tyr、Ile、Ser、Gly和Asn殘基形成強氫鍵。根據圖3：肽與Keap 1顯示出強SAS，這可能與抗氧化肽和Keap 1之間存在相當大的范德華力有關。表明抗氧化肽與Keap 1的結合主要是通過氫鍵作用和SAS來實現的。總體而言，對接結果表明LY-4、LP-5和VL-9可能占據了Keap 1-Kelch結構域中Nrf 2的結合位點，從而抑制了Keap 1和Nr 2的相互作用，釋放出游離的Nrf 2，促進了Nrf 2的積累，從而促進了抗氧化基的表達。

MDA由脂質過氧化作用產生，可與磷脂交聯并被蛋白質中存在的巰基氧化，其含量變化被用作生物體中氧化應激的重要指標，并間接表征由ROS引起的對細胞的氧化損傷的強度。如圖4（f）所示，與對照組（0.052 ± 0.020 nmol/mg蛋白）相比，AAPH誘導組的MDA含量（0.713 ± 0.026 nmol/mg蛋白）顯著增加（p < 0.001）。抗氧化肽LY-4、LP-5和VL-9預處理顯著降低了MDA的產生（p < 0.001）。同時，與AAPH誘導組相比，肽處理后細胞MDA水平的顯著降低與ROS的降低一致，以上結果表明，LY-4、LP-5和VL-9三種抗氧化肽均能抑制ROS誘導的脂質過氧化反應，從而保護AAPH誘導的HepG 2細胞氧化損傷。一些研究已經報道，抗氧化肽可以通過增強抗氧化酶（即CAT、SOD和GSH-Px）的活性并降低ROS和MDA含量來保護細胞免受氧化損傷在本研究中，基于分子對接和細胞實驗的結果，FBBP衍生的抗氧化肽（LY-4、LP-5和VL-9）的潛在作用機制總結于圖5中。

文章總結：

綜上所述，基于計算機模擬和體外抗氧化活性分析，從FBBP中鑒定并合成了7個新的抗氧化肽，具有較強的抗氧化能力，其中LY-4、LP 5和VL-9具有最強的抗氧化和細胞保護作用。分子對接結果表明，3種抗氧化肽均能較容易地進入Keap 1的結合口袋，Arg 415和Arg 483殘基在與Keap 1蛋白的結合中起關鍵作用，氫鍵和SAS是主要的相互作用表面力。這些抗氧化肽可能具有通過占據Nrf2和Keap1的結合位點來激活Keap1-Nrf2途徑的潛力。此外，它們通過降低ROS和MDA水平對氧化損傷的HepG2細胞產生保護作用。這些結果有助于發現更多新的抗氧化肽，加深對抗氧化作用機制的認識，并為食品副產物的高效利用提供理論依據，但需要進一步的研究來確定其細胞活性和動物模型中的體內效應。